肝穿刺获得的肝脏条索组织用10%中性甲醛固定,之后依次石蜡包埋、切片,行HE染色;由温州医科大学附属二院病理科2名专家阅片,病理诊断标准参照《慢性乙型肝炎防治指南》[6],评定标本的炎症分级(G)和纤维化分级(S)。根据病理炎症结果将50例病例分为两组:A组:炎症G0;B组:炎症≥G1。 1.6 免疫组化检测肝脏组织PD-1表达 石蜡切片脱蜡、水化,3%双氧水孵育,双蒸水冲洗,PBS浸泡,枸橼酸缓冲液中微波修复,PBS冲洗,血清封闭,室温孵育后倾去血清,滴加PD-1一抗工作液,37℃孵育,PBS冲洗后滴加二抗工作液,37℃孵育,PBS冲洗,滴加辣根酶标记SP工作液,37℃孵育,PBS冲洗,之后DAB显色剂显色,苏木素复染。梯度酒精脱水、透明、封片。用图像分析软件Image-Pro Plus6.0重复3次读取每张片的阳性区域的吸光度值,取平均值作为蛋白的相对含量。 1.7 统计学分析 采用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析,计量资料组间比较t检验;相关性分析使用非参数检验Spearman(斯伯曼/斯皮尔曼)法分析;P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1血清标志物和病毒学指标 50例患者肝功能在正常范围,ALT(31.20±11.81)U/L,均为HBeAg(+),HBV DNA:10^5~10^8拷贝/mL。病理学结果见表1。并根据炎症结果分为两组:A组26例(炎症G0)和B组24例(炎症≥G1)。A组病例中S2分级的6例,B组病理中S2分级的6例,S3分级的有3例,病理分级炎症≥G2或纤维化≥S2的例数为15例。 2.2 血清肝纤维化指标检测结果 A组和B组患者4种血清肝纤维化指标水平均无统计学差异(见表2)。 2.3 免疫组化检测肝脏组织PD-1表达结果 A组患者肝脏组织PD-1平均光密度值为(1.56±0.39),B组为(2.87±0.62)。B组患者肝脏组织PD-1表达水平明显高于A组(t=9.05,P<0.05)。50例患者纤维化S0级(11例)PD-1平均光密度值为(1.86±0.52),纤维化S1级(24例)PD-1平均光密度值为(2.07±0.69),纤维化S2级(12例)PD-1平均光密度值为(2.58±0.65),纤维化S3级(3例)PD-1平均光密度值为(2.82±0.15)。 2.4 PD-1与肝纤维化相关性分析 PD-1表达与肝纤维化分级呈正相关,相关系数rs=0.356,P=0.011<0.05。PD-1表达与肝脏炎症分级呈正相关,相关系数为rs=0.780,P=0.000<0.05。 3 讨论 乙肝病毒感染是我国最常见的肝脏感染性疾病,据统计慢性HBV感染者约9300万人,而其中慢性HBV携带者占了很大的比重[6]。慢性HBV携带者,经各项检查如肝功能以及CT、B超等影像学检查往往无明显异常的发现。但是,近年来愈来愈多的研究提示,乙肝进展具有“隐蔽性”,许多ALT正常的慢性HBV感染患者,同样存在肝损害,部分患者病变程度在G2、S2以上,甚至进展到早期肝硬化阶段[7,8]。本研究中也同样存在这样的情况,50例患者虽肝功能均正常范围,影像学亦无明显异常,但病理分级炎症≥G2或纤维化≥S2的例数为15例。 PD-1是一种抑制性共刺激分子,在维持外周耐受中起着关键性的作用。既往的研究表明,PD-1与病毒感染后病毒特异性T淋巴细胞功能衰竭及免疫耐受有关,其抑制病毒的清除,有助于病毒感染的慢性化[9];Tao等[10]使用流式细胞仪检测37例慢性丙肝病毒感染患者与17例正常健康者的血标本,结果发现丙肝病毒慢性感染者CD8+淋巴细胞上PD-1表达强度及百分比均较高于正常组。 研究也发现PD-1在乙肝病毒清除过程中发挥负性调控作用,与HBV慢性感染密切联系[5,11]。免疫耐受是HBV感染慢性化的主要机制,PD-1通过切断自身反应性T细胞诱导免疫耐受,并抑制效应性T细胞维持免疫耐受[12]。因此,HBV的持续感染与PD-1的表达上调有关。随着对PD-1研究的深入,更有研究发现,肝脏组织中PD-1表达与炎症程度具有相关性。韦麒等[5]研究发现随着炎症活动度的加重,PD-1的表达也更为显著。但是目前对于慢性HBV携带者患者肝组织PD-1表达的临床研究鲜有报道。 |